mRNA LNP疗法：这才哪跟哪儿？

Author: Mika Huang Date: September 3, 2024

近十年来，基于脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles，LNPs)载体开发的信使核糖核酸(mRNA)疗法已经进入临床试验招募阶段。新冠疫情爆发后，Pfizer/BioNTech和Moderna公司开发的mRNA疫苗在全球范围内广泛使用，更是将mRNA疗法推向了全新的高度。虽然这些mRNA疫苗针对COVID-19表现出了高的保护率，其中Pfizer/BioNTech的BNT162b2保护率可高达94%，但是免疫反应失控和药物干预不当代来的安全性和副作用仍然不容忽视。

本文将对mRNA药物的主要组成——LNP（递送系统）和mRNA分子分别与免疫系统之间的相互作用展开讨论，并探讨靶向修饰策略和新一代递送系统的开发，为在临床中通过调节药物的免疫反应来改善mRNA疗法的治疗效果提供新的思路。

图1. mRNA LNP对抗癌症和传染性疾病

一、mRNA递送系统

mRNA的应用主要包括蛋白质替代疗法、癌症免疫治疗、疫苗、细胞重编程和基因编辑等。然而，mRNA的应用主要受限于体内递送的挑战，如核酸酶的降解，缺乏稳定性，内体捕获等。此外，mRNA的免疫毒性也是其成药能力的另一大挑战。因此，通过核酸修饰以提高mRNA的稳定性和开发高效的mRNA递送平台成为mRNA疗法的重中之重。

其中，递送平台主要分为病毒载体（天然）和非病毒载体（人工合成）两大类（图2）。病毒载体具有高效的宿主细胞转染能力以及低脱靶效率，然而所引发的免疫原性和细胞毒性问题、反向基因组插入风险、瞬时基因表达控制和载体大小限制也成为其主要限制因素。相比于病毒载体，非病毒载体则普遍表现出更低的先天免疫刺激和细胞毒性，且可通过靶向递送实现多个组织的有效转运，并避免与非靶细胞的非特异性相互作用。

图2. mRNA的载体类型

学术界和工业界曾尝试开发基于鱼精蛋白、高聚物和脂质纳米颗粒等多种类型的非病毒递送系统，其中脂质纳米颗粒因低毒性和高的体内转染效率而被选择，并寄予厚望。

目前，LNP主要成分包括阳离子脂质、辅助型脂质、胆固醇以及PEG脂质等（图3）。其中胆固醇和PEG脂质可以提高颗粒的稳定性和延长纳米粒药物在血液的循环时间，增强mRNA递送转染效率，但是阳离子脂质则一定程度上会诱发细胞毒性的产生。此外，mRNA-LNP样本的尺寸、分散性、包封率、空壳率以及体系中游离核酸等因素均会影响其生物分布、递送效率和免疫反应等。因此，不论在生产过程还是最终产品，mRNA递送系统的严格质量控制都是至关重要的。

图3. mRNA LNP结构示意图

纳米流式检测仪是一款可在单颗粒水平实现纳米颗粒多参数表征的设备，具有高灵敏度、高选择性以及高通量等优点。在mRNA-LNP分析方面，可以实现其粒径分布、颗粒浓度、空壳率、包封率以及核酸定位等指标的表征。如图4所示，在二维散点图中可轻松分辨装载了mRNA分子的LNP（红色）以及空载的LNP颗粒（蓝色），同时可轻松获取不同粒径LNP颗粒与其药物装载量的关系；在颗粒浓度表征中，所得的mRNA LNPs的事件数与梯度稀释显示出良好的线性，说明该设备对LNPs颗粒浓度计数的高度准确性。

图4. 纳米流式检测仪对mRNA LNPs分析

二、mRNA-LNP与免疫系统

免疫系统作为机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统，最基本的功能是识别自己和非己。免疫系统遇到不同形态、大小和表面电荷的物质时，会引发相应的免疫应答。如图5所示，目前已有研究利用mRNA LNPs引发的机体免疫反应，从而清除机体中的肿瘤细胞。但是，药物制剂中若存在过多的游离核酸或者未装载核酸的LNP，则有可能引发免疫系统的过度应答，从而诱发炎症反应，甚至导致超敏反应的发生。为避免这一情况的发生，研究者们通过表面特异性修饰、调整给药途径以及提高装载效率等策略以降低mRNA LNPs可能引发的非必要免疫反应。

图5. mRNA LNP通过DC细胞杀伤肿瘤细胞的机制

如图6所示，经核酸染料标记，纳米流式检测技术可轻松实现mRNA LNPs、LNPs空壳和游离核酸这三种成分的分辨，并且将其展示在同一个二维散点图中。该方法可帮助研究者获取产品的纯度以及杂质来源等重要信息，从而指导优化上游合成和分离纯化等工艺，快速提升产品的纯度，降低杂质含量。

图6. mRNA LNPs（P1）、LNPs空壳（P2）和游离mRNA（P3）同时分析

纳米药物表面的靶向配体修饰是改变药物的组织分布和动力学特性的的重要手段。修饰配体的类型、取向和密度等因素均参与和影响着下游的细胞响应。基于纳米流式检测技术，厦门大学颜晓梅教授团队以靶向配体修饰的脂质体为模型，建立了一种纳米药物表面靶向配体密度的定量表征策略。作者通过该方法考察了不同脂质体制备方法、配体投入量及表面聚合物修饰等对脂质体表面的配体的异质性及密度分布的影响，并进一步阐述了脂质体表面的有效配体修饰密度对细胞靶向结合的影响。

三、mRNA-LNP与药理学

基于LNP的mRNA的递送效果与给药方式和LNP的组成、修饰密切相关。目前，mRNA LNP的递送系统在肿瘤治疗和对抗传染病中都取得了显著的成就，如在黑色素瘤、淋巴瘤、肝细胞癌、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌等肿瘤的治疗中都表现出了明显的肿瘤细胞杀伤效果，并延长了患者的生存期（表1、表2）。另一方面，mRNA疫苗更是在治疗高遗传不稳定性和感染性疾病等领域表现出了非凡的优势，如mRNA-1273（Moderna疫苗）和BNT162b2，Comirnaty（Pfizer/BioNTech疫苗）获得FDA紧急使用授权用于应对新冠疫情的爆发和全球大流行。此外，针对其他病毒的流行病的mRNA LNP候选疫苗也处于临床前和临床试验阶段（表2），如艾滋病毒、季节性流感疫苗、寨卡病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）和EB病毒等。

表1. mRNA LNP在癌症中的应用

表2.处于临床阶段的mRNA LNP癌症和传染病疫苗

虽然LNP递送载体极大提高了mRNA的体内递送和表达效率，并在临床中被广泛使用，但是其可能引发的发热、疼痛和肿胀等不良反应也不容忽视。因此，mRNA LNP疫苗和药物的制备和生产工艺仍然需要进一步优化完善，这也对其质量控制和稳定性跟踪提出了更高的要求。

四、总结与展望

LNP同时兼具佐剂和载体的特点，这也使得基于LNP开发的mRNA疫苗展现出了稳定性高、细胞摄取高等优势，在肿瘤和传染性疾病防治中均表现出了巨大的潜力。LNP可能引起的免疫反应作为其药代动力学和安全性的主要标准。由于LNP的化学成分、可能的微生物污染以及其他免疫刺激剂等都是免疫原性的主要决定因素，将影响mRNA递送的药代动力学和药效。因此，在LNP的制备、mRNA包装和质控、成品的稳定性跟踪等各个方面进行实时监测必不可少。

细胞外囊泡（外泌体）是真核细胞和原核细胞分泌的天然存在的纳米颗粒。相比于人工合成的载体，外泌体作为一种天然的纳米药物递送载体具有免疫原性低、较长的体液循环时间和跨越血脑屏障等优势，被认为是理想的新一代药物递送载体（图7）。目前已经有众多案例利用外泌体进行核酸药物的递送。今年美国北卡罗来纳州立大学的程珂教授团队利用人肺球细胞来源的EVs通过电穿孔法装载编码新冠病毒刺突蛋白的mRNA，开发了一种基于外泌体的室温稳定型可吸入冻干粉mRNA疫苗，该疫苗可以在室温环境下至少稳定保存28天。

图7. 游离药物，人工合成纳米颗粒和EVs的特征

经过数十年的发展，人工合成的药物在临床上累积了很多失败的教训和成功的经验。合成纳米医学和EV领域之间更多的对话和合作的增加可能会赋能初露头角的EV生物学与合成药物的成功融合。

纳米流式检测仪

纳米流式检测技术作为纳米颗粒多参数表征的重要技术手段，无论在外泌体还是mRNA LNP的综合表征方面都展现出巨大的优势。基于散射光和荧光信号的多参数检测对纳米药物的粒径分布、颗粒浓度、载药比例、载药量以及核酸定位分析的定量表征方法。纳米流式检测仪的应用贯穿整个药物研发、工艺优化、大规模生产、质量控制、稳定性评估等整个过程（图8），为纳米药物的研发和质量控制提供重要的技术保障，这将极大加快核酸疗法的基础研究和临床转化进程。

图8. NanoFCM检测参数

参考文献

1.Kiaie SH et al. Recent advances in mRNA-LNP therapeutics: immunological and pharmacological aspects. J Nanobiotechnology. 2022, 20(1), 276.

2.Witwer KW.et al. Extracellular vesicles versus synthetic nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Materials, 2021, 6(2), 103-106.

3.Popowski et al. Inhalable dry powder mRNA vaccine based on extracellular vesicles. Matter, 2022, 5(9), 2960-2974.

4.Tam YY et al. Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA Delivery. Pharmaceutics. 2013, 5(3), 498-507.

5.Chen C et al. Quantification of Available Ligand Density on the Surface of Targeted Liposomal Nanomedicines at the Single-Particle Level. ACS Nano. 2022, 16(4), 6886-6897.

6.Zhu S et al. Light-scattering detection below the level of single fluorescent molecules for high-resolution characterization of functional nanoparticles. ACS Nano. 2014, 8(10), 10998-1006.