福流生物
Carmine创始人团队：红细胞来源EVs靶向治疗白血病
Author: Mika Huang Date: October 20, 2022
急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukaemia, AML)是最高发的一种成人血癌。虽然 2/3 的AML患者经化疗和靶向治疗后能达到完全缓解，但是高达60% – 65%的年轻成人患者会在三年内复发，致使生存率急剧下降。治疗性的寡核苷酸(ASO)可高特异性地与癌基因结合，并使其沉默，是一种极具前景的AML治疗策略。然而，目前可安全、有效递送ASO的方法还相对匮乏。
细胞外囊泡(EVs)作为新一代的递送工具，在解决ASO递送难题中极具潜力。然而由于产量的限制，基于EV的药物递送方法尚处在早期阶段。血细胞是非常理想的EVs来源。在细胞体外培养体系中，细胞密度通常为~1E6 cells/mL，但人血液中的红细胞(red blood cells, RBC)浓度就可高达5E6 cells/uL。因此，RBCs来源的EVs(RBCEVs)在作为递送载体时具有其天然优势。
新加坡国立大学的Minh T. N. Le团队及合作者们建立了大规模纯化RBCEVs的标准方法，从每单位的血液(200 mL全血)中可以快速获取高达1013-1014 EVs，这些RBCEVs被用于装载包括ASOs、gRNAs以及Cas9 mRNA在内的多种核酸药物，在人类细胞和异种移植小鼠模型中均展示出高度稳定的miRNA抑制以及CRISPR-Cas9基因编辑能力。
近日该团队在Cell Proliferation(IF = 8.8)上发表题为“CD33-targeting extracellular vesicles deliver antisense oligonucleotides against FLT3-ITD and miR-125b for specific treatment of acute myeloid leukaemia”的研究型文章。通过对红细胞来源的EVs(Red Blood Cell-derived EVs, RBCEVs)表面修饰靶向抗体和内部装载ASO，开发了一种用于AML治疗的靶向ASO药物递送系统，极大地提高了治疗效果(图1)。
结果显示，靶向修饰了CD33抗体的RBCEVs可以被AML细胞高效吸收，同时RBCEVs内部装载的ASO则显著降低了AML细胞中FLT3-ITD或miR-125b的水平。
图1. 红细胞来源EVs的工程化流程图
红细胞来源的RBCEVs可以被白血病癌细胞吸收，也会在非癌细胞中积累，CD33作为一种常见的白血病标志蛋白，在绝大多数AML细胞表面高表达。由于成熟红细胞缺乏基因组，无法通过基因工程手段对其改造，作者创新性地开发了一种酶—生物素/链霉素—抗体连接的新策略，以实现靶向蛋白与EVs的稳定、高效连接 (图2)。
图2. EVs表面靶向抗体修饰策略
作者首先利用NanoFCM对该靶向抗体的修饰结果进行了分析，结果表明成功修饰CD33抗体的EVs可达74.8%，且同型对照IgG的修饰比例为73.6%，说明该方法在连接过程中对修饰蛋白本身无选择性，理论上可用于在EVs表面修饰任何感兴趣的目标蛋白。
图3. NanoFCM评估EVs靶向抗体修饰效果
后续作者验证了修饰CD33抗体的RBCEVs可被AML细胞高效吸收。体内实验表明，CD33修饰的EVs可以显著的在小鼠骨髓、肝脏、脾脏等部位富集，表明CD33抗体的修饰，使得RBCEVs可特异性的进入白血病相关细胞。作者进一步在RBCEVs中分别装载FLT3-ITD ASO和miR-125b ASO这两种药物，结果显示这些装载了ASO的RBCEVs可以显著抑制白血病的进展。
图4. 靶向修饰和装载ASO的RBCEVs治疗白血病效果
总结
使用人类红细胞作为递送治疗性RNA的EVs的来源，有以下优点：
1.无细胞核和线粒体DNA，有效避免了水平基因转移的风险；
2.红细胞数量多，是人体内最丰富的细胞类型（其含量占所有体细胞的84%）；
3.红细胞易获取，几十年来的常规输血已经证实了它的安全性；
4.RBCEVs稳定性好，在-80℃条件下可长期稳定保存，即使经过多次冻融仍可维持结构完整。基于电穿孔等成熟装载方法，可有效实现RBCEVs中ASOs的装载，且该表面蛋白修饰策略的开发也极大提高了RBCEVs靶向AML相关细胞的能力，从而显著抑制白血病的进展。
RBCEVs的递送策略加速和推进着治疗性ASOs的临床转化，这将为白血病患者带去福音。
本文的通讯作者Minh T. N. Le博士是Carmine Therapeutics的创始人和Advisor。Carmine Therapeutics是一家专注于利用红细胞膜EVs发展创新基因疗法的生物科技企业，公司愿景是使基因药物广泛普及，以满足患者未满足的医疗需求。在2020年6月，Carmine与武田制药签订超9亿美元的科研合作协议，致力于发现、开发以及商业化非病毒基因疗法，基于前者开发的红细胞胞外囊泡的REGENT平台实现两种罕见疾病相关靶标的开发和商业化。
参考文献
· Chen H, Jayasinghe M K, Yeo E Y M, et al. CD33‐targeting extracellular vesicles deliver antisense oligonucleotides against FLT3‐ITD and miR‐125b for specific treatment of acute myeloid leukaemia[J]. Cell Proliferation, 2022: e13255.
· Pham C T, Zhang X, Lam A, et al. Red blood cell extracellular vesicles as robust carriers of RNA-based therapeutics[J]. Cell Stress, 2018, 2(9): 239.
· Usman W M, Pham T C, Kwok Y Y, et al. Efficient RNA drug delivery using red blood cell extracellular vesicles[J]. Nature communications, 2018, 9(1): 1-15.
