叮咚！收下这份完整的慢病毒表征攻略

Author: Mika Huang     Date: September 5, 2023

在临床应用中，慢病毒作为细胞与基因治疗的常用载体，相关制剂的纯度和质量均需符合GMP标准。而慢病毒生产过程中会引入非病毒成分的杂质（如细胞碎片、蛋白聚集体）和病毒成分的杂质（如空壳病毒、游离RNA等）。因此，对生产过程中以及慢病毒终产品进行多维度的定量分析必不可少，亟需一种快速、高通量的慢病毒颗粒滴度、纯度、空壳率等指标的检测方法。

NanoFCM基于自身的技术平台开发了一种高灵敏、快速、直接、无创的慢病毒表征解决方案，在前期研发、生产、纯化、质控、稳定性评估等各个阶段均具有极高的应用价值。该方法操作简单、检测速度快、准确性高、适用性广，适用于不同种类的病毒样颗粒和病毒载体的分析。主要优势如下，

低损耗

仅需（10 mＬ）上样量，且单次检测样品消耗量不足1 mＬ。

多参数

单次检测可实现多种结构组分鉴定，为慢病毒颗粒滴度、纯度、空壳率等信息提供快速检测方案。

高通量

检测仅需2-3 min即可获得高通量并具有统计代表性的数据结果，拥有完整的试剂解决方案，无需摸索实验流程。

图.慢病毒高通量表征平台

本期小编将基于慢病毒的表征平台展开方案介绍：

粒径、浓度检测

纳米流式检测仪以每分钟高达上万个颗粒的检测速率实现单个慢病毒的逐一检测，获得具有统计代表性的粒径分布和浓度信息（如下图1所示），也可快速获得不同亚群的信息，对慢病毒样品进行梯度稀释，NanoFCM的检测结果与稀释度呈现很好的线性结果（R²>0.99）。这种多、快、省的检测方法，可用于慢病毒生产过程中增殖状态的实时监控。

图1. 慢病毒粒径、浓度和稀释线性测试

膜染料测定纯度

我司研发的膜染料可对慢病毒生产过程中无膜结构的颗粒进行纯度分析，经脂膜染料标记，结果显示该慢病毒样本纯度为91.2%（如图2所示），揭示慢病毒样本中绝大部分为具有膜结构的颗粒，且荧光强度与颗粒粒径正相关。

图2. 膜染料标记的慢病毒纯度（膜染料订购信息如下表所示）

核酸包装效率分析

核酸染料可透过慢病毒荚膜及衣壳蛋白，与内部核酸分子结合而发出荧光。如图3所示，该慢病毒载体样本中绝大部分的颗粒成功装载了基因组（89.7%），但仍存在一部分未装载核酸的慢病毒颗粒。

图3. 核酸染料标记的慢病毒纯度（核酸染料订购信息如下表所示）

慢病毒膜内蛋白p24测定

经膜透化试剂处理和抗体标记，NanoFCM可对慢病毒荚膜内部的蛋白进行定量分析，从而实现p24等慢病毒内部蛋白的检测。下图4显示的是该慢病毒样本中，p24阳性率仅为55.1%，结合上述荚膜和核酸染色的数据揭示并非所有的慢病毒颗粒均有p24蛋白的表达。

图4. 病毒内部蛋白p24检测（p24检测相关试剂订购信息如下表所示）

功能性慢病毒测定

慢病毒样本中往往是多种组分共存，如完整慢病毒、部分组装的慢病毒、游离核酸等。VSV-G阳性的慢病毒可侵染细胞——“识别”，核酸阳性慢病毒携带靶基因——“货物”，故功能完整的慢病毒需要同时具有基因组和VSV-G。如下图5所示，通过对慢病毒样品进行核酸和VSV-G蛋白荧光标记，NanoFCM仅需要2-3 min就可以区分完整病毒、空壳、游离核酸等不同结构。

图5 功能性慢病毒颗粒检测（病毒组分鉴定相关试剂如下表所示）

慢病毒滴度测定比较

慢病毒滴度测定常通过ELISA对p24进行定量分析进而计算出慢病毒物理滴度，或通过侵染活性测试确定转导滴度。与p24定量方法相比，NanoFCM可直接测定慢病毒的颗粒浓度，通过对荚膜内p24蛋白的标记，实现p24阳性的病毒颗粒的定量分析。进一步通过核酸和VSV-G标记，发展了对功能性慢病毒进行快速定量分析的方法。基于NanoFCM发展的慢病毒定量分析方法与转导滴度的结果对比（如图6），结果表明该慢病毒的particle-to-PFU ratio为100以上，针对p24蛋白的ELISA病毒滴度测定极易受游离p24蛋白的影响，相比之下NanoFCM所得结果与病毒的物理滴度更为吻合。

图6. 慢病毒滴度测定