外泌体载药策略：你选对了吗？

Author: Mika Huang     Date: March 7, 2023

外泌体由于其内源性来源、组织特异性以及良好的生物相容性和血液循环时间长等特点，被视为一类理想的小分子药物递送载体，可用于提高姜黄素、紫杉醇、阿霉素、醉茄素A等小分子药物的有效性和药代动力学。目前基于外泌体的药物装载策略主要分为纯化前载药和纯化后载药两大类。前者通过对亲本细胞进行修饰改造，而实现外泌体的药物装载；后者则是对纯化后外泌体通过物理以及化学等方法进行药物装载，其中大多借鉴了脂质体药物递送系统的经验。

厦门大学颜晓梅教授团队在Analytical and Bioanalytical Chemistry上发表题为“Single‑particle assessment of six different drug‑loading strategies for incorporating doxorubicin into small extracellular vesicles”的文章，以阿霉素(Doxorubicin, Dox)为模型药物，利用nFCM（纳米流式）在单颗粒水平对六种药物装载策略（共孵育、电穿孔、挤出法、反复冻融、超声和表面活性剂处理）进行对比，综合评估几种方法对sEVs药物包封率、药物装载量、表面蛋白功能维持、长期保存稳定性等影响，为基于sEVs的药物装载和递送研究提供了一个快速、灵敏的单颗粒分析方法。

图1. nFCM评估EVs药物装载策略

EVs质量控制

选用HEK293T来源的EVs装载Dox作为标准模型，研究六种药物装载策略对装载Dox药物的效果。经过超速离心的方法从293T细胞上清中分离得到纯化的EVs，首先对EVs粒径、形态、纯度、蛋白等进行表征，评估获取的EVs的质量。利用Triton X-100处理的方法评估EVs的纯度，nFCM结果显示在经Triton X-100处理后，EVs颗粒数明显下降，EVs的纯度高达80%；粒径结果也显示EVs粒径均在220 nm以下，峰值为52 nm，中位值为103 nm，符合MISEV2018中建议的EVs粒径分布范围（图2）。

图2. EVs的鉴定和表征

载药策略对比

由于Dox具有自发荧光特性，与未装载Dox的EVs相比，装载了Dox的EVs表现出明显的橙色荧光信号，阳性颗粒的比例可达46.3%；在共孵育方法中，随着Dox浓度的增加，阳性EVs的比例持续上升，当Dox浓度为100 μM时，EVs的阳性率达到最高，接近50%（图3）；

以优化后的Dox浓度(100 μM)为参考，评估对比了共孵育、电穿孔、挤出法、反复冻融、超声和表面活性剂处理这六种方法对EVs载药效率、颗粒浓度、药物装载量等影响。结果显示共孵育和电穿孔法具有最高的装载效率，均为40%以上，而其他几种药物装载策略阳性率在20%-30%之间（图3）。总的来说，考虑到药物包封率、颗粒浓度、药物装载量等因素，共孵育和电穿孔是这几种方法中最理想的EVs药物装载策略。

图3. 不同药物装载策略的载药效率、药物装载量对比

生物功能分析

EVs表面蛋白是其功能形式的重要参与者，对EVs的免疫逃逸和靶向具有重要作用，作者进一步研究了不同药物装载策略对EVs表面蛋白的影响。结果发现，共孵育和电穿孔方法处理后EVs的表面蛋白(CD24、CD47、CD63)表达比例相对更高，说明这两种方法能够最大限度地保持了EVs的生物活性，而挤出法、反复冻融、超声和表面活性剂处理都会不同程度地破坏EVs的表面蛋白（图4）。

图4. 不同载药策略对EVs表面蛋白的影响

作者进一步评估了不同策略所得载药EVs中药物稳定性和活性（图5）。结果显示在4℃和-80℃条件下保存，随着时间的延长，六种装载策略获得的EVs阳性率均出现下降，而共孵育方法获得的EVs在长期保存下还能保持较高的药物包裹效率（约40%）。综上，无论何种载药方式，都建议将装载Dox的EVs储存在4℃，且共孵育制备的Dox-EVs显示出最高的包封率和稳定性。

图5. 载药后EVs的稳定性研究

药物作用效果

作者还探究了不同药物装载策略所得Dox-EVs的药物活性和细胞摄取效率。共聚焦显微镜和流式细胞术的结果均证实电穿孔的方法获得的EVs具有更高的细胞摄取效率，同时更容易诱导细胞凋亡（图6）。该结果与nFCM测定的不同方法药物包封效率和药物包裹量相吻合，说明了Dox-EVs的治疗效果与细胞摄取率密切相关，并从本质上与Dox的包封率有关，揭示了利用nFCM对EVs进行单颗粒载药表征的准确性和重要价值。

图6. 不同载药策略的药物活性

总结

本研究利用nFCM在单EV水平对六种不同的载药策略进行了全面的评估。实验结果表明：

• 共孵育和电穿孔方法可以获得更高的装载效率，单个EVs中Dox含量也最高；

• 共孵育和电穿孔方法制备的EVs药物具有更高水平的细胞摄取和更显著的促进肿瘤细胞凋亡；

• 共孵育方法获得的EVs无论在4℃或-80℃长期保存条件下，均具有更好的稳定性；

nFCM作为一个高效的单颗粒表征平台，可应用于EVs研究的各个环节，包括分离纯化、质量控制、EVs载药方法评估和优化、稳定性监测等方面，加速推进EVs产业化的发展！

参考文献

Chen, C., Li, Y., Wang, Q. et al. Single-particle assessment of six different drug-loading strategies for incorporating doxorubicin into small extracellular vesicles. Anal Bioanal Chem 415, 1287–1298 (2023). https://doi.org/10.1007/s00216-022-04248-4