CAR-T疗法——已在风口，期待卓越

Author: Mika Huang     Date: December 7, 2021

随着复兴凯特生产的阿基仑赛注射液（弈凯达）和药明巨诺瑞基奥仑赛注射液（倍诺达）两款CAR-T产品获批上市，在国内癌症治疗领域掀起了一股CAR-T研究的热潮，业内人戏称2021年是中国的免疫细胞治疗元年。相较于化疗、放疗和手术等传统的癌症治疗方法，CAR-T疗法具有精准、快速、高效的特点，被认为是最有前景的癌症治疗方法之一。

CAR-T疗法介绍和关键

CAR-T 疗法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy），即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是通过基因工程的手段将T细胞激活，并装上“定位导航装置”CAR分子，将T细胞改造成专门识别肿瘤细胞的“超级战士”高效杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。

CAR-T整个生产流程包括：分离和富集T细胞、T细胞活化、T细胞修饰、体外CAR-T细胞扩增，以及末端工艺和冷冻保存，整个制造周期一般需要2～4周。其中T细胞修饰主要是在T细胞表面表达CAR分子，是赋予普通T细胞特异性识别肿瘤表面抗原能力的关键，是CAR-T生产的关键环节。

图1.CAR-T治疗流程（图片来源于网络）

而CAR分子的表达系统包括病毒载体递送系统和非病毒载体递送系统两大类。目前全球已上市的六款CAR-T产品均采用病毒载体转导的方式，除了吉利德旗下Kite的Yescarta和Tecartus采用了γ-逆转录病毒载体转导系统；其它四款都是基于慢病毒载体开发生产的，分别是诺华的Kymriah、百时美施贵宝（BMS）旗下Juno Therapeutics的Breyanzi，BMS 和Bluebird bio联合开发的Abecma，以及药明巨诺开发的relma-ca。慢病毒载体已成为CAR-T细胞生产过程中的主要载体，随着CAR-T疗法的应用推广，对于GMP级慢病毒需求量必将日益增长。下面将对慢病毒生产面临的问题和挑战进行阐述。

CAR-T疗法挑战—GMP级慢病毒生产

慢病毒生产流程通常包括上游的细胞培养、病毒包装，下游主要有病毒澄清、纯化、过滤、浓缩、除菌等步骤。慢病毒整个生产流程的难点在于质粒瞬转的工艺控制与GMP工艺放大，在慢病毒生产过程中存在着大量杂质，如细胞碎片、空壳病毒、牛血清白蛋白（BSA）聚集物和游离核酸（来自宿主/质粒的DNA残留）等杂质。这些杂质与成熟的病毒粒子共存，因此GMP级慢病毒载体生产需要严格质量控制，以保证慢病毒纯度、效价和安全性。

慢病毒生产还同时面临放大生产难度大、成本高（占CAR-T生产成本的30%）、缺乏有效表征技术、无公认的国际标准等问题，进一步限制了CAR-T疗法的推广与应用。因此一个快速、简便的表征方法将有助于促进慢病毒大规模生产优化与质量监控，降低CAR-T生产成本，建立规范的慢病毒生产质量标准。

图2.慢病毒生产流程（图片来源于网络）

慢病毒表征利器—NanoFCM

早期业内一直认为只要慢病毒能够携带目的基因就可以达到基因传递的目的。然而，病毒能否将基因传递到宿主细胞有两个关键因素：

1.病毒表面携带VSV-G蛋白，能够与宿主细胞表面的受体特异性结合（“识别”）；

2.病毒本身成功携带了目的基因（“递送”）。

所以在优化病毒载体的生产工艺时，内部核酸和表面蛋白的检测都应该成为受到关注的因素。

纳米流式（NanoFCM）单颗测检测平台，可在单颗粒水平对病毒颗粒的浓度、粒径、纯度、特异性蛋白等进行定性和定量分析。可从粗提混合物中区分完整病毒、病毒空壳、游离核酸等不同组分，对病毒进行定性检测和定量分析（【COVID19热点】——病毒疫苗快速检测 新方法 ），优化产毒条件和纯化工艺，为慢病毒从研发到生产提供一站式解决方案。

下图展示的是NanoFCM对慢病毒的VSV-G和核酸同时标记的结果，慢病毒具有四个不同组分，包括同时具有VSV-G和核酸的完整病毒、有VSV-G无核酸的空壳慢病毒、有核酸无VSV-G的无侵染能力的慢病毒、其他组分等颗粒。其中只有完整慢病毒才具有侵染和传递CAR的功能，而其他慢病毒组分不具备完整的功能。另外，NanoFCM可对蛋白表达量进行定量分析，通过比较不同公司的VSV-G蛋白表达量和比例发现，不同来源的慢病毒VSV-G表达存在差异（数据未展示），而VSV-G是慢病毒侵染T细胞的关键蛋白，这提示慢病毒生产需要关注病毒蛋白表达强度对感染T细胞效率的影响。

图3.慢病毒不同组分、构造鉴定

NanoFCM可应用于慢病毒工作流程的各个阶段，从研发—生产—纯化—质控等各个流程，助力慢病毒规模化生产，降低病毒载体成本，加速CAR-T疗法的产业化进程。

图4.NanoFCM应用于慢病毒的各个环节

展望

目前全球共有六款CAR-T治疗药物上市，集中在CD19和BCMA两个靶点。此外，还有CD30、CD33、CD22等，均是治疗血液肿瘤的靶点。而在实体瘤中，CAR-T疗法比较理想的有针对肝癌的GPC3靶点，针对胃癌的CLDN 18.2靶点，以及针对卵巢癌的Mesothelin（MSLN，间皮素）靶点等，临床结果积极，值得期待。

此外，将CAR分子应用于不同免疫细胞，使其具有靶向治疗功能成为一种趋势，如UCAR-T、CAR-NK、CAR-M等不同免疫细胞的应用。UCAR-T通过敲除健康供者T细胞上的TCR基因和HLA-1基因，消除排斥反应，使其成为一种通用型CAR-T产品，有望极大降低治疗费用，成为CAR-T未来发展的趋势；而CAR-NK产品具有更高的安全性，不会产生细胞因子风暴，可使用健康人或脐带血中的NK细胞，或从iPSC诱导分化为NK细胞，是另外一种通用型现货细胞疗法，可以减少患者的等待时间和降低治疗费用等。

总的来说，随着CAR-T相关技术的发展，CAR-T产品朝着通用性、高安全性方向发展。其中病毒载体成本占据CAR-T生产很高的比例，加之未来对病毒载体需求激增，病毒大规模生产成为亟需解决的问题。NanoFCM将一如既往地为慢病毒研发和生产提供解决方案，为CAR-T疗法保驾护航。

参考文献：

• Niu, Qian, et al. “Quantitative Assessment of the Physical Virus Titer and Purity by Ultrasensitive Flow Virometry.” Angewandte Chemie 133.17 (2021): 9437-9442.
• Ma L, et al. Label‐Free Analysis of Single Viruses with a Resolution Comparable to That of Electron Microscopy and the Throughput of Flow Cytometry. Angewandte Chemie, 2016, 55(35):10239-10243.
• http://www.bioceltech.com/en/product.html