前景诱人：外泌体分离方法新突破

Author: Mika Huang     Date: September 24, 2021

近年来，细胞外囊泡（Extracellular vesicles, EVs）的研究持续升温，成果显著，大量证据表明EVs在多种疾病的诊断、治疗、以及预后监测方面有重要的临床价值。同时该领域也面临诸多挑战，分离纯化方法的选择是其中尤为重要的一个。如何从复杂的临床样本中获得高纯度的EVs呢？

2019年小编曾推送过一篇EVs分离纯化相关的文章《做外泌体，我的分离纯化方法靠谱吗？如何质控？》，厦门大学颜晓梅教授团队综合比较了5种商品化EVs纯化试剂盒和超离的效果，发现与超离相比，几种试剂盒提取的EVs的纯度仍有差距，我们也在持续关注EVs分离纯化方法的新进展。

近日，暨南大学的王通教授和崔毅峙博士团队在国际顶尖细胞外囊泡杂志JEV（IF=25.84）上发表题为 “Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications”的文章，通过优化纯化柱颗粒孔径、填充体积、洗脱体积等改进SEC，发展了二分式SEC法（dichotomic SEC）。利用NanoFCM对分离纯化的EVs进行粒径、浓度、纯度、生化性质等进行评估，发现二分式SEC法只需1次大体积洗脱（总耗时约22分钟）即可将血清/血浆等复杂体液分成两个组分，快速分离获得高纯度EVs，有望加速EVs的临床中研究和成果转化。

图1.二分式SEC法技术开发流程图

EVs分离优化策略

通过对比CL-2B、CL-4B、CL-6B三种纯化柱，发现纯化柱的孔径会影响血清来源EVs的分离纯化效果。CL-4B和CL-6B对EVs纯化效果优于于CL-2B，对牛血清样品（FBS）处理后可看到有两个明显的颗粒峰（蓝色）和蛋白峰（红色），并且峰形较为对称，而对于人血清样品（HS），三种纯化柱均有较明显的后拖峰出现（图2）。随后作者考察了树脂填充量对EVs分离的影响，结果发现随着填充树脂体积的增大（20 mL），CL-6B对EVs分离纯化的效果得到显著改善，而洗脱液体积对EVs分离纯化效果影响较小。

图2.不同优化条件对EVs分离纯化影响

EVs的质量评估

对二分式SEC纯化后获得的EVs有必要进行纯化效果的综合评估，选取SW620细胞上清作为研究模型，分别通过物理性质和生化性质几方面评估二分式SEC法获得的EVs样品的粒径分布、颗粒浓度、纯度等信息。

a.物理性质和纯度检测

传统的WB通过检测EVs标志蛋白Integrin β3和杂质蛋白（如ApoA1）来反映EVs的纯度，WB结果显示EVs主要存在于Eluate 1组分中，而污染物在Eluate 2组分。通过NanoFCM（纳米流式）在单颗粒水平对纯化获得的EVs的颗粒浓度、粒径、纯度等进行无标记直接分析，发现洗脱的两个组分中，颗粒大小基本一致，说明EVs和杂质颗粒大小差不多，SEC无法分离大小差不多的杂质颗粒。然后用Triton X-100破膜剂处理评估EVs的纯度，EVs因具有膜结构可被破膜而杂质蛋白颗粒不受影响，对比Triton X-100处理前后EVs颗粒数的变化可计算EVs的纯度。NanoFCM结果显示，二分式SEC法获得的EVs纯度高达96.9%（图3），证明该分离方法可获得高纯度的EVs。

图3.WB和NanoFCM测定EVs纯度

b.生化性质和纯度检测

用CFDA-SE 标记SW620细胞（标记细胞膜内的蛋白），经二分式SEC法纯化EVs，利用NanoFCM对EVs的生化性质进行检测，测得阳性颗粒的比例和纯度； NanoFCM显示二分式SEC法提取的EVs颗粒中荧光阳性的比例高达95.5%，其中92.4%的颗粒可以被Triton X-100裂解，进一步说明二分式SEC法可以获得高纯度的EVs。另外值得指出的是，NanoFCM可实时观察各通道的原始数据和背景水平，组分Eluate 2（蛋白峰）的荧光背景水平明显高于Eluate 1（颗粒峰），再次验证蛋白峰比颗粒峰具有更多的蛋白颗粒（图4）。

图4.NanoFCM测定EVs比例和纯度

综上，王教授和崔博士团队优化了SEC方法，开发出二分式SEC法（dichotomic SEC），经过NanoFCM的多维度分析验证，此方法不仅可获得与超速离心法相近纯度的EVs，而且EVs的得率也显著提高。

展望和应用

王通教授和崔毅峙博士团队研发的二分式SEC方法只需两步洗脱即可快速获得高纯度的EVs，已经在牛血清、人血清以及细胞上清等样品中得到验证。这种方法简单、实用，在临床试验和基础研究中具有诱人的潜力，同时小编也期待王教授团队能够尽快把产品推向市场，使更多的科研和临床工作者获益。

NanoFCM是一款单颗粒纳米颗粒分析仪器，可对7-1000nm的纳米颗粒粒径、浓度、纯度和生化性质等进行表征，是研究EVs纯化方法、生化性质的重要技术手段，可应用在EVs生产、纯化、载药等各个方向，加快EVs在临床上的应用和转化。

参考文献：

• Jiahui,Guo, et al. ” Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications” Journal of extracellular vesicles 2021;10:e12145.
• Tian, Ye, et al. “Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nano-flow cytometry.” Journal of extracellular vesicles 9.1 (2020): 1697028.