牛奶外泌体

Author: Mika Huang     Date: February 15, 2023

细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）作为天然的药物递送载体表现出了独特的优势，但其药物装载效率低下仍是目前亟待解决的一个问题。受脂质体纳米药物活性载药策略的启发，作者报道了一种名为“Sonication and Extrusion-assisted Active Loading”（SEAL）的方法，用于高效和稳定的EVs药物包装。以阿霉素负载的牛奶衍生EVs（Dox-mEVs）为模型，结合超声/挤出技术暂时渗透EVs膜，促进硫酸铵溶液流入管腔，建立主动装载所必需的跨膜离子梯度。与被动装载相比，SEAL的药物包封效率提高了约10倍。针对传统的包封率测定无法揭示EVs装载异质性，难以准确评估载药效率的问题，该研究利用了NanoFCM这一单颗粒水平纳米分析利器对Dox-mEVs进行了粒径分布、颗粒浓度及装载效率的测定，并结合脂膜荧光标记和免疫荧光染色等方法进行多参数表征，快速优化分离纯化策略提高载药囊泡颗粒的比例。最终，通过细胞实验进一步阐明了药物分子装载效率及载药囊泡颗粒纯度对mEVs药物递送能力的影响。文中提出的SEAL载药方法及基于NanoFCM的载药效率表征策略能够为EVs的工程化应用及评估提供借鉴。

图1. Dox-mEVs的载药效率

图2. 磁珠法提高主动载药囊泡颗粒比例

应用NanoFCM对牛奶外泌体载药的情况进行多参数的综合分析，评估药物装载效率并逐步进行优化，基于NanoFCM的载药效率表征策略可以为EVs的工程化应用提供参考。

J Extracell Vesicles, 2021, 10:e12163.

红细胞来源外泌体靶向治疗白血病

Author: Mika Huang     Date: February 15, 2023

急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukaemia, AML）是最高发的一种成人血癌。虽然 2/3 的AML患者经化疗和靶向治疗后能达到完全缓解，但是高达60% – 65%的年轻成人患者会在三年内复发，致使生存率急剧下降。治疗性的寡核苷酸（ASO）可高特异性地与癌基因结合，并使其沉默，是一种极具前景的AML治疗策略。然而，目前可安全、有效递送ASO的方法还相对匮乏。细胞外囊泡（EVs）作为新一代的递送工具，在解决ASO递送难题中极具潜力。然而由于产量的限制，基于EV的药物递送方法尚处在早期阶段。血细胞是非常理想的EVs来源。在细胞体外培养体系中，细胞密度通常为~1E+6 cells/mL，但人血液中的红细胞（red blood cells, RBC）浓度就可高达5E+6 cells/μL。因此，RBCs来源的EVs（RBCEVs）在作为递送载体时具有其天然优势。在这项研究中，作者将外泌体进行工程化载药和修饰，并利用纳米流式检测技术对修饰后的外泌体进行表征。

                                                                                      图1. EVs表面靶向抗体修饰策略                                                                            图2. NanoFCM评估EVs靶向抗体修饰效果

利用NanoFCM对该靶向抗体的修饰结果进行了定性表征和定量分析，结果表明高达74.8%的EVs表面成功修饰了CD33抗体，且73.6%的EVs修饰了同型对照IgG，二者没有显著差异，可以用于下游的对比试验。后续的体内实验证明装载了ASO的RBCEVs可以显著抑制白血病的进展。纳米流式检测技术在外泌体修饰结果的验证方面起到了非常关键的作用，有望推动工程化外泌体药物的发展。

Cell Prolif., 2022, 55(9):e13255.

外泌体递送抗体药

Author: Mika Huang     Date: February 15, 2023

美国Codiak公司开发的exoIL-12是世界上首个进入临床的工程化外泌体候选药物。Codiak公司研究人员通过密度梯度离心获取高纯度的外泌体，并用蛋白质谱方法对纯化的外泌体样本进行分析，发现在外泌体上EWI免疫球蛋白超级家族和MARCKS蛋白家族中的五种蛋白（支架）存在高表达现像。经过基因改造，这些支架蛋白上可以附加各种生物分子或药物，如细胞因子、抗体片段、RNA结合蛋白、疫苗抗原等，是一个非常理想的药物递送平台。

研究人员通过基因工程的方法使这几种支架蛋白带上GFP标签，并尝试用传统流式和ELISA的方法进行定性和定量分析。然而，传统流式的结果只能定性证明这几种蛋白在细胞水平上有表达，无法证明目的蛋白是否被有效包装到了EV中；ELISA可以判断某种蛋白是过表达的，却无法提示这种过表达在EVs中是普遍存在还是在某个亚群中富集，所以有必要在单颗粒水平对EVs进行分析。纳米流式检测仪在支架蛋白的鉴定中发挥了重要作用，在单个EVs的水平对几种支架蛋白的表达进行分析，发现PTGFRN蛋白在外泌体中表达比例高达97%，是一种非常理想的支架蛋白。相比于半定量的Western Blot以及只能提供一个均值的ELISA方法，纳米流式检测仪不仅可以判断阳性亚群的比例，其荧光强度还可以反映单个EVs颗粒上蛋白表达量的信息。

图1. PTGFRN支架蛋白和IL-12融合表达示意图

图2. 纳米流式分析外泌体上不同蛋白的表达比例

应用纳米流式首次在外泌体水平对基因改造后的PTGFRN外泌体进行单颗粒检测，传统ELISA只能对大量外泌体上的蛋白进行定量分析，纳米流式检测仪可以在单个外泌体水平对蛋白的表达进行鉴定和定量分析，发现PTGFRN比例高达97%，是一种非常理想的支架蛋白。

Molecular Therapy, 2021, 29(5), 1729-1743.

核酸药物

Author: Mika Huang     Date: February 15, 2023

最近有研究表明，胞外囊泡（extacellular vesicles, EVs）携带DNA。本研究采用纳米流式检测仪（NanoFCM），散射光通道可检测粒径低至40 nm的单个EVs的信号，荧光通道可实现SYTO 16标记的单个200 bp的DNA片段的检测。通过同时对单个粒子进行侧向散射和荧光（FL）检测，并结合酶处理，本研究发现：

1）游离的DNA大量存在于细胞培养物制备的EV样品中；

2）单个EVs中EV-DNA的数量表现出很大的异质性，DNA阳性（DNA+）EVs的数量在30%到80%不等，具体取决于细胞类型；

3）外部EV-DNA主要定位在相对较小的EVs上，通过抑制外泌体分泌途径可显著降低DNA+EVs的分泌；

4）内部EV-DNA主要包装在相对较大的EVs的内腔；

5）双链DNA（dsDNA）是外部和内部EV-DNA的主要形式；

6）EVs中未发现组蛋白（H3），EV-DNA与组蛋白不相关；

7）基因毒性药物诱导DNA+EVs的释放增加，和外部DNA+EVs和内部DNA+EVs的数量以及单个EVs中的DNA含量均显著增加。

这项研究为深入了解EVs装载核酸药物提供了直接和决定性的实验证据。

                                                                                             图1. EVs中DNA的分布情况                                                          

图2. EVs中核酸种类鉴定

图3. 抗肿瘤药物促进EVs和DNA的分泌

首次发现尺寸排阻色谱(SEC）不能有效地将游离DNA从EVs中分离出来，而密度梯度离心可去除绝大部分游离DNA。加入这项研究为深入了解EVs装载核酸药物提供了直接和决定性的实验证据。

J Extracell Vesicles, 2022, 11:e12206.

脂质体与外泌体融合

Author: Mika Huang     Date: February 15, 2023

通过基因工程的手段在成纤维细胞外泌体表面表达CD47蛋白，用装载了抗癌药物的热敏脂质体与CD47过表达的外泌体发生融合，制备出外泌体-脂质体杂化颗粒（gETL NPs），该颗粒既可以表达CD47以逃逸机体的免疫清除，又有效包装了抗癌药物，能够有效抑制肿瘤的发展。纳米流式可在单颗粒水平对脂质体和外泌体进行分析，对融合的效果进行评估，优化融合条件；另外，相较传统的WB或ELISA只能在整体水平对颗粒进行表征，纳米流式检测仪可在单个外泌体或脂质体水平对其表达的蛋白进行定性、定量分析，优化蛋白或药物包裹效率。

                                                                                   图1. 外泌体-脂质体融合的检测                                                 图2. 外泌体-脂质体纳米颗粒CD47表达比例检测

纳米流式检测仪在单颗粒水平分析PSPE-PEG-FITC标记的脂质体和纯化的外泌体，得到阳性颗粒比例和粒径分布信息。经纳米流式检测仪分析，相比于未改造的 ETL NPs（5.36%），经基因改造后的 gETL NPs 表面 CD47 的表达比例高达56.84%，可以避免纳米药物被机体免疫系统清除，显著提高治疗效果。

Adv. Sci., 2020, 7(18), 2000515.