凭借CGT载体表征方案，NanoFCM再次出圈

Author: Mika Huang Date: March 16, 2023

过去的一年，在其它创新药领域面对市场寒冬时，细胞与基因治疗仍然一路高歌猛进，愈发受到资本市场的青睐。据深蓝观不完全统计，2022年全球细胞与基因治疗(Cell and Gene Threapy, CGT)市场的融资规模已达到200亿美元，被寄予了很高的期望，可谓风云正起。CGT中最具代表性的案例是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy, CAR-T)，目前该疗法已有八款产品获批上市，治愈了全球数以万计的血液肿瘤患者。CAR-T也已经不甘于原先血液疾病的窄小应用，正在逐渐探索实体瘤领域的可能性。

但CAR-T疗法在商业化的过程中涌现出来的问题也值得我们深思。首先是高昂的定价让很多患者望而却步，目前上市的疗法中大多都处于供不应求的状态，有的患者甚至要等候六个月才能接受CAR-T治疗。现阶段的CAR-T疗法远远无法满足患者的需求，产能不足严重限制了CAR-T疗法的前景。其中慢病毒载体的产能不足是被吐槽最严重的一个缺陷，其面临的困境主要包括生产成本昂贵、生产耗时过长、工艺难以规范等。慢病毒载体的生产成本约占 CAR-T疗法总成本的1/3，且因为缺乏行之有效且快速的质控手段，导致慢病毒的生产过程非常漫长。因此，建立成熟可靠的病毒载体质量控制体系对于整个CAR-T疗法甚至CGT领域意义非凡。今天小编重点为您介绍一种Robust的技术方法，助您在CGT载体研发、生产质控中做到降本增效。

慢病毒载体及表征现状

首先，我们来了解一下慢病毒。慢病毒载体（结构如图1）是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒, 80-120 nm）为基础发展起来的基因治疗载体，主要由荚膜、蛋白壳及内部包裹的RNA构成。慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主细胞的染色体上，从而实现外源基因的稳定表达。

图1. 慢病毒结构示意图

目前慢病毒滴度的检测方法主要有如下几种：

基于病毒侵染活性的转导滴度法(transducing units, TU)；
基于实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)的基因组的拷贝数测定；
基于酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)的病毒p24蛋白浓度分析；

以上三种方法因其在检测某一指标时固有的优势而被广泛应用，但无一例外，三种方法都是基于整体特征检测的bulk方法，难以揭示病毒样品的异质性，此外，耗时长、对样品纯度要求高、无法评估样品纯度等问题也是传统方法的局限性。

慢病毒载体能否将基因传递到宿主细胞有两个关键因素:

1.识别：病毒外膜VSV-G蛋白（一种水泡性口炎病毒G糖蛋白）的表达，决定了与宿主细胞表面的受体的特异性结合；

2.递送“货物”：慢病毒成功装载了目的基因。

因而在优化病毒载体的生产工艺时，表面膜蛋白的表达及内部核酸的装载均应该成为关注的关键点。

在临床应用中，慢病毒作为细胞与基因治疗的常用载体，相关制剂的纯度和质量均需符合GMP标准。而慢病毒生产过程中会引入非病毒成分的杂质（如细胞碎片、蛋白聚集体）和病毒成分的杂质（如空壳病毒、游离RNA等）。因此，对生产过程中以及慢病毒终产品进行多维度的定量分析必不可少，亟需一种快速、高通量的慢病毒颗粒滴度、纯度、空壳率等指标的检测方法。

NanoFCM解决方案

NanoFCM（图2）基于自身的技术平台开发了一种高灵敏、快速、直接、无创的病毒检测方法，该方法操作简单、检测速度快、准确性高、适用性广，适用于不同种类的病毒样颗粒和病毒载体的分析。同一分析中，仅需（10 uL）上样量，且单次检测样品消耗量不足1 uL，在单颗粒水平对粒径及分布、颗粒浓度等物理参数表征的基础上，可进一步对慢病毒的多种结构组分：VSV-G蛋白、基因组、衣壳蛋白、荚膜等进行精确分析，实现慢病毒载体样品的综合表征，NanoFCM为慢病毒颗粒滴度、纯度、空壳率等信息提供快速检测方案，且该多参数检测方案仅需2-3 min即可获得高通量并具有统计代表性的数据结果，在前期研发、生产、纯化、质控、稳定性评估等各个阶段均具有极高的应用价值。

图2. NanoFCM仪器图示

NanoFCM在慢病毒表征中的应用

01 不同研发生产阶段慢病毒样品中病毒相关组分检出

凭借超高的散射和荧光检测灵敏度，NanoFCM可实现对慢病毒（80-120 nm）粒径范围内不同组分的表征，也可实现样本环境中单个游离RNA的检测。如下图3所示，通过对慢病毒样品的递送“货物”核酸和病毒外膜VSV-G“识别”蛋白进行荧光标记，NanoFCM在2-3 min内就可以区分完整病毒、空壳、游离核酸等不同结构，助力研发和生产阶段的病毒质量评估。

图3. 功能性慢病毒颗粒检测

02 慢病毒粒径分布及颗粒浓度表征

NanoFCM以每分钟高达上万个颗粒的检测速率实现单个慢病毒的逐一检测，获得具有统计代表性的粒径分布和浓度信息（如下图4所示），也可快速获得不同亚群的信息，对慢病毒样品进行梯度稀释，NanoFCM的检测结果与稀释度呈现很好的线性结果（R²>0.99）。这种多、快、省的检测方法，可用于慢病毒生产过程中增殖状态的实时监控。

图4. 慢病毒粒径、浓度和稀释线性测试

03慢病毒生化性质定性、定量分析

此外，NanoFCM还可基于一定的标记策略，实现纯度、核酸包裹效率、内膜蛋白p24检测、不同工艺VSV-G蛋白等生化指标的快速测定→详细的检测方案可联系NanoFCM客服获取。

04对标经典方法

基于NanoFCM发展的慢病毒定量分析方法与转导滴度的结果对比（如图5），结果表明该慢病毒的particle-to-PFU ratio为100以上，针对p24蛋白的ELISA病毒滴度测定极易受游离p24蛋白的影响；相比之下NanoFCM所得结果与病毒的物理滴度更为吻合。

图5. 慢病毒滴度测定

小结

NanoFCM全新发布的慢病毒解决方案一经推出，引发领域研究者的关注和讨论热潮，截止目前，已有多家领域头部的企事业单位，购买了纳米流式检测仪。究其原因是，NanoFCM提供了一种单颗粒水平、无创且快速的慢病毒多维表征方案，解决了传统表征方法耗时、整体性检测无法揭示样品异质性的问题，为已有的检测方法提供更快速的正交和验证手段，可广泛应用于慢病毒载体构建的研发、工艺优化及质控等环节，助力CGT企业的病毒载体质控。

Tip：如您希望进一步了解纳米流式在慢病毒表征中的应用方案或者申请仪器试用，可扫描下方客服二维码或联系区域销售获取。

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