一文读懂 | 脂质纳米药物靶向修饰研究新进展

Author: Mika Huang     Date: September 3, 2024

纳米药物是指通过纳米技术将传统小分子化疗药物或蛋白、核酸等大分子药物，通过自组装或装载于纳米载体上形成具有纳米尺度结构的一类药物，纳米药物已经被广泛应用于癌症治疗、基因转染、疾病诊断、肿瘤成像、疫苗生产和微型医疗装置制造等生物医药领域。

通过在纳米药物表面偶联与靶细胞受体特异性结合的配体改变药物在体内的分布和药物动力学特性是实现其肿瘤精准靶向递送的重要手段，该方法也被称之为肿瘤主动靶向策略。目前，该策略已被用于包括脂质体在内的多种纳米颗粒表面功能化修饰及肿瘤靶向递送与治疗。尽管该方法已有无数的应用案例，但仍无一款主动靶向的纳米制剂获得临床批准。究其原因，主要是靶向配体的引入可能导致脂质体免疫原性的增强、诱导纳米药物发生非靶器官聚集，甚至加速体内清除速率，产生脱靶效应。因此，在单颗粒水平对脂质体表面偶联的配体数量及其密度分布进行准确定量，对揭示其功能化异质性并阐明功能化与纳米药物细胞靶向结合能力的影响至关重要。

针对该问题，今天小编想介绍一篇近期发表在ACS Nano上的文章，题为“Quantification of Available Ligand Density on the Surface of Targeted Liposomal Nanomedicines at the Single-Particle Level”，厦门大学颜晓梅团队基于纳米流式检测技术及定量流式分析方法建立了一种新型的配体靶向修饰和密度定量表征策略，并据此揭示脂质体制备方法、配体投入量及表面聚合物修饰对配体密度分布及其异质性的影响，定量阐明配体修饰对脂质体细胞靶向结合的作用。

一、配体密度定量表征方法建立

以叶酸这一常见的肿瘤靶向功能分子作为配体模型制备主动靶向型脂质体，并对其进行表征（图1）。作者提出了可利用配体的概念，即脂质体表面真正能够与细胞表面受体结合的这部分叶酸。作者以荧光标记的叶酸受体作为检测探针，排除部分被PEG屏蔽或活性位点变性失活的配体。以荧光硅球作为标准品，对其等价荧光分子当量进行标定，结合叶酸受体的荧光标记比实现脂质体表面叶酸含量及其分布的绝对定量。通过对粒径和叶酸个数的二维散点图进行拟合发现二者的相关系数为2.27，和理论上配体个数应该和表面积成正相关比较符合。将脂质体视为完整的球型结构，即可计算出叶酸配体的密度及其分布。可以看到尽管合成的脂质体粒径及配体含量存在一定异质性，但配体密度分布相对均匀。

图1. 基于NanoFCM的脂质体表面叶酸密度定量表征

二、配体密度与细胞结合能力的定量分析

基于配体密度定量表征结果，作者进一步研究了靶向配体密度对脂质体细胞摄入的影响。通过改变叶酸的投入量制备了一系列具有不同配体修饰程度的脂质体，并利用纳米流式对叶酸密度进行定量分析。然后，将这些脂质体进行膜荧光标记，并与叶酸受体高表达的细胞孵育，通过流式细胞术分析荧光强度。结果表明，随着叶酸密度的增加，细胞荧光强度呈现先增加后下降的趋势，其中适合配体密度约为每100平方纳米0.5~2个叶酸。该数值与绝大多数病毒表面的抗原密度相近，从这当中我们是不是能获得靶向纳米药物设计的一些启发呢？

图2. 叶酸配体密度与脂质体细胞靶向结合能力分析

三、配体偶联方法优化

接下来作者考察了制备方法的差异（图3）。脂质体的靶向功能化修饰有两种主流的方法，一种是预修饰法，即直接将连有靶向配体或者活性官能团的磷脂和其他磷脂辅料共同混合，一步合成脂质体。结果表明，该方法制备的脂质体表面配体分布较为均匀，但由于有接近50%的磷脂分布于内表面，可利用配体含量相对较低。第二种是后插入法，既将功能化磷脂嵌入预制备好的脂质体中。该方法的好处为大多数磷脂均分布于脂质体外表面，可利用率较高，但是修饰效果与脂质嵌入的条件密切相关。在充分加热和搅拌的情况下进行磷脂嵌入时叶酸分布较为均匀，且配体密度约为预修饰法的2倍。但在缺乏热处理及搅拌时，脂质体表面的配体分布呈现显著的异质性，绝大多数脂质体仅修饰了少量叶酸，少部分脂质体则修饰了过量的叶酸。而根据前述结论，叶酸修饰不足或过量都不利于脂质体与细胞的结合。因此，结合细胞实验表明，不均匀修饰的叶酸脂质体细胞靶向能力显著低于另外两组样品。值得指出的是，若根据平均配体密度分析，三组样品都应呈现较好的细胞靶向能力，说明仅通过集权平均分析，不考虑纳米药物理化性质的分布和异质性平均值会对其潜在的细胞作用方式乃至体内行为产生错误的理解和预判。

图3. 配体偶联方式对脂质体表面叶酸配体分布的影响

四、PEG修饰对脂质体表面可利用叶酸含量的影响

在脂质体药物的发展过程中，PEG修饰是提高其稳定性，增加体内循环时间的一个重要方式。然而，在主动靶向制剂中，PEG的覆盖可能会影响靶向配体与受体的结合。因此，作者利用建立的可利用配体定量检测方法对表面修饰不同分子量PEG的叶酸脂质体进行表征。结果表明，随着PEG分子量的增加，脂质体表面可利用叶酸的分布异质性没有显著改变，但含量逐渐下降，与细胞的结合能力也逐渐降低。因此，纳米流式能够为优化纳米药物PEG修饰条件提供快速准确的表征手段。

图4. 脂质体表面PEG分子量对其可利用叶酸含量分布的影响

五、总结展望

通过靶向配体修饰提高纳米颗粒对特定疾病组织的递送能力是未来纳米药物发展的一大方向。针对纳米药物表面配体密度的表征难题，本文借助纳米流式的多参数定量检测能力建立了脂质体表面叶酸配体的表征方法，考察了多种制备条件对其配体修饰异质性的影响，并以定量分析的视角阐明了配体密度与脂质体细胞结合能力的关联。随后，作者还将该方法应用于转铁蛋白和HER2抗体等两种截然不同的靶向配体中，并得出了相似的结论，进一步证明了该方法的普适性。相信今后基于纳米流式的定量检测分析必将更广泛地运用于其他类型的纳米颗粒中，并成为功能化纳米药物发展的强有力支撑。（感谢陈超翔博士撰稿）