分离纯化方法 – 福流生物

Notice: Undefined index: HTTP_ACCEPT_LANGUAGE in /www/wwwroot/www.nanofcm.cn/wp-content/plugins/NanoFCMEditor/main.php on line 25
分离纯化方法 – 福流生物

分离纯化方法

分离纯化方法评估

Author: Mika Huang Date: February 15, 2023

细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）具有多种生物学功能，可参与机体免疫应答、抗原递呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等，在多种疾病和生理过程中扮演重要的角色。限制EVs发展的挑战之一是缺乏公认的EVs分离的有效方法。在这项研究中，作者选取血浆、细胞上清、尿液三种典型样本作为EVs的来源，对比超速离心（UC）、沉淀（Precipitation）、尺寸排阻加超滤（SEC+UF）、微流控（Exodisc）等纯化方法，通过纳米流式检测技术对分离的EVs进行得率、纯度、表面蛋白表达分析综合评估它们的纯化效果，最后基于样本类型和下游应用，对分离纯化方法的选择提出了切实可行的建议。

图1. 不同纯化方法获得的EVs颗粒浓度图2. EVs颗粒蛋白比（纯度）分析

图3. 密度梯度离心分析EVs纯度图图4. EVs表面蛋白标志物分析

图5. 基于样本来源和下游应用选择合适的EVs分离方法

该研究中，作者通过纳米流式检测技术对EVs进行多参数的表征，评估适合不同样本类型的纯化方法，总结出基于样本来源和下游应用的不同选择适合的纯化方法的结论，并提供了切实可行的建议。

J Extracell Vesicles, 2020, 10(2):e12044.

临床外泌体分离优化

Author: Mika Huang Date: February 15, 2023

为了实现血浆等复杂环境外泌体的快速分离，为外泌体的临床应用提供支撑，研究人员发展了二分式尺寸排阻色谱法（size exclusion chromatography, SEC），通过优化柱颗粒孔径、填充体积、洗脱体积等参数，成功从复杂的血浆样本中纯化得到外泌体样本。通过NanoFCM测定发现二分式SEC法仅需一次大体积洗脱（总耗时约22分钟）即可将血清/血浆等中的颗粒区分为两个组分—— 外泌体和非外泌体。该方法可高效分离获得高纯度外泌体，有望为临床诊断中外泌体的快速分离纯化提供支撑。

图1. NanoFCM优化血浆外泌体分离新技术

经过NanoFCM的多维度分析验证，此方法不仅可获得与超速离心法相近纯度的EVs，而且EVs的得率也显著提高。

J Extracell Vesicles, 2021, 10:e12145.

商品化试剂盒对比

Author: Mika Huang Date: February 15, 2023

由于细胞外囊泡存在于细胞培养液以及血液、乳汁、尿液、腹水等多种复杂的生物环境中，且不同来源甚至同一来源的EVs在尺寸、形态和生化特性等方面存在着很大差异，因此，有效的分离纯化方法和检测手段是EVs走向临床的两大瓶颈。目前EVs的分离纯化方法主要有超速离心法、尺寸排阻法、聚合物沉淀法和免疫亲和法等。那么，这些EVs的分离纯化方法的纯化效果如何呢？在单颗粒水平对EVs进行表征对于EVs纯化方法的评估具有重要意义。EVs的单颗粒表征方法主要有冷冻透射电镜（cryo-TEM）、纳米颗粒追踪技术（NTA）和可调电阻脉冲传感技术（TRPS），虽然cryo-TEM可以对小粒径的EVs进行表征，但是其通量低、耗时长，获得的信息通常缺乏统计代表性，NTA和TRPS均难以实现粒径小于70 nm的EVs的表征。因此，cryo-TEM、NTA和TRPS均难以满足EVs的日常检测需求。

纳米流式检测仪为EVs检测开辟了蹊径，可以在无标记的情况下，对粒径低至40 nm的单个细胞外囊泡进行散射光的直接检测。该研究利用纳米流式检测仪，从EVs的颗粒浓度、粒径分布、纯度、表型和回收率等方面，综合比较了超速离心法以及五种商品化试剂盒（ExoQuick、Total Exosome Isolation、qEV Columns、Ultrafiltration和exoEasy）提取的EVs。该研究为EVs相关领域的研究者们提供了一套评估方法，研究者们可以根据结论选择适合自己的分离纯化方法。

图1. 不同纯化方法得到的EVs的粒径分布和颗粒浓度图2. 不同纯化方法提取PFP和VD-PFP得到的EVs的颗粒浓度

图3. 不同纯化方法得到的EVs的纯度表征图4. 不同纯化方法得到的EVs的回收率表征

图5. 不同分离纯化方法得到的EVs的表型分析

NanoFCM的分析结果表明，UC分离方法得到的EVs的纯度达78％，而ExoQuick、Total Exosome Isolation、qEV Columns、Ultrafiltration和exoEasy五种快速分离纯化试剂盒提取的EVs纯度都较低；对于EVs的表面蛋白的鉴定，试剂盒提取的EVs也需用超离的方法进一步去除杂质颗粒，才能得出与UC相一致的结果；总的来说，常用的试剂盒提取方法与传统的超速离心方法比较还存在较大差距。

J Extracell Vesicles, 2019, 9(1), 1697028.

从体液中获得真正的外泌体

Author: Mika Huang Date: February 15, 2023

由于细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)在疾病诊断以及治疗领域的巨大潜力，被视为液体活检和药物递送的明日之星。围绕这些小囊泡的基础研究持续升温，在工业界亦是炙手可热。但是，EVs的来源环境往往极其复杂，如细胞培养上清、血液、尿液以及腹水等生物体液，其自身在粒径、组成成分等方面与杂质颗粒存在重叠，如何从复杂环境中纯化得到高质量的EV样本，一直是该领域面临的重要挑战。

目前在血浆等体液来源外泌体的研究中，差速离心结合密度梯度离心的方法是当前最广泛使用的高纯度外泌体分离方法。但该方法耗时长、操作繁琐、难以平衡颗粒得率和产物质量且过高的离心力不可避免地对EV的完整性和组成成分造成不同程度的影响。因此，这些因素限制了该方法向临床应用和工业界的转化。

图1. 基于电镜及NanoFCM的EVs单颗粒表征

研究人员结合免疫印迹、TEM和NanoFCM等多种表征方法，通过对FFE法进行优化，实现了从组成成分高度复杂的体液样本中快速、高通量地分离纯化得到EVs。结合NanoFCM检测平台，有望进一步实现EVs相关生物标志物的检测，从基础研究到临床应用均展现出巨大潜力。

Journal of Extracellular Biology, 2022, 1, e71.