不同来源的外泌体

不同来源外泌体的综合表征

Author: Mika Huang Date: February 7, 2023

一、物理性质：粒径分布和颗粒浓度

不同来源的的细胞外囊泡，在尺寸、形态和生化特性等方面存在着巨大的差异性。对细胞外囊泡在单颗粒水平进行表征，对于深入研究囊泡运输系统、细胞通讯机制以及疾病的早期诊断和治疗等均具有非常重要的意义。另外，为了验证细胞外囊泡的颗粒粒径分布是否具有临床价值，需要对其粒径分布进行重复分析。

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二、蛋白质分析

目前，学术界对外泌体的起源还没有一个清晰的定论，许多研究者认为外泌体是在多泡体融合细胞膜时形成的。然而，许多研究方法分离出来的颗粒是细胞外囊泡的混合物。EVs的研究领域还不够成熟，尚没有发现能把EVs的某种亚群与其它成分区分开的特异性的标志物，比如鉴别细胞膜直接分泌的和多泡体融合细胞膜分泌的EVs。早期的研究认为CD9、CD81和CD63是外泌体的特征标志物，随着研究的深入，现在已经很清晰这些跨膜蛋白不能代表外泌体的特征标志物，但是它们在外泌体中存在过表达的现象。国际细胞外囊泡协会（International Society for Extracellular Vesicles, ISEV）认为CD9、CD81和CD63等这些标志物，可以用于区分EVs和非EVs的颗粒。

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三、脂质和核酸分析

早期的研究认为，EVs执行蛋白运输功能，特异性靶向受体细胞，交换蛋白和/或脂类引发下游信号事件。2007年，研究人员发现EVs也能够运输核酸，参与细胞之间的通讯。总之，EVs通过膜上的蛋白质和脂类等信号分子，以及膜内包裹的内容物（神经递质、酶、激素和核酸等）在细胞之间的通讯和机体调控中发挥作用。所以除了研究蛋白质的功能以外，有必要在单颗粒水平对EVs的RNA和脂类等进行多参数的综合表征。

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细菌囊泡的多参数分析

Author: Mika Huang Date: February 8, 2023

细菌囊泡（bacterial membrane vesicles, BMVs）是细菌在生长过程中分泌的纳米尺度的脂质小泡，其携载的核酸、蛋白质，特别是毒力因子和免疫调节因子等，进行种间、种内以及与宿主的信息交流和物质交换。BMVs不仅影响多种生物过程，而且在疫苗和抗癌药物研发方面显示出重要的应用价值。但是，由于BMVs具有高度的个体差异性、粒径微小且内容物稀少，其纯化和表征均面临严峻挑战。BMVs的异质性与其功能密切相关，高纯度BMVs样本的获得是深入研究BMVs分泌机制和生物学功能的先决条件。

目前，常用的BMVs分离纯化方法主要包括超速离心、超滤、体积排阻色谱等，获得高纯度的BMVs样品，并对其纯度进行定量评估，也是BMVs研究急需解决的难题。该研究利用纳米流式检测仪在单颗粒水平对纳米粒子进行高灵敏、高通量分析的独特优势，结合差速离心和密度梯度离心对BMVs进行分离纯化，建立了BMVs的纯度、浓度及粒径分布的单颗粒水平定量表征方法。

图1. BMVs纯度和浓度测定

图2. 纳米流式检测仪表征BMVs的粒径分布

该研究基于纳米流式检测仪建立了一种在单颗粒水平对BMVs纯度、浓度及粒径分布进行表征的方法，有望为BMVs更深层次的生物学功能研究提供有力的技术支持。

CHINESE J ANAL CHEM, 2021, 49(5), 733-742.

尿液细胞外囊泡的多参数表征

Author: Mika Huang Date: February 14, 2023

尿液来源的细胞外囊泡（urinary extracellular vesicles, uEVs）作为新一类液体活检标志物，在疾病诊断、治疗监控等方面展现出广阔的应用前景。然而，由于缺乏相应的表征技术，研究者对于纳米尺度uEVs的粒径分布、颗粒浓度以及生化表型等均缺乏了解。EVs具有高度个体差异性和多样性，因此迫切需要发展高通量、多参数的单颗粒检测技术。本研究利用纳米流式检测仪，对超速离心法纯化得到的uEVs进行单颗粒水平的多参数定量表征，得到其纯度、浓度、粒径、DNA、RNA和蛋白标志物等的综合信息。

图1. uEVs的粒径分布

图2. uEVs的浓度和纯度分析图 3. uEVs的核酸分析

图4. uEVs的蛋白标志物分析

经过免疫荧光标记分析，uEVs的CD9、CD63、CD81和CD24的阳性率分别为26. 8%、21. 0%、6. 0% 和19. 9% 。纳米流式检测仪可为uEVs的生化性质研究和临床应用提供重要的表征平台。

CHINESE J ANAL CHEM, 2021, 48(10), 1305-1314.

眼泪外泌体的多参数表征

Author: Mika Huang Date: February 14, 2023

体液来源的细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）在液体活检领域展示出广阔的应用前景。泪液的收集具有快速、安全和无创等优点，但泪液相关的EV研究较少，其参与的生理和病理过程在很大程度上是未知的。该研究使用纳米流式检测仪在单颗粒水平分析和表征泪液中的EVs，揭示了人群的异质性。通过侧向散射检测分析泪液EVs的粒度分布和颗粒浓度，通过免疫荧光标记评估CD9、CD63、CD81、CD47、CD45、CD24和EpCAM的表达情况，并对比泪液和唾液EVs中组织凝血活酶（tissue factor, TF）的阳性率和丰度等信息，为进一步探索泪液EVs的功能提供了理论支撑。

图1. 泪液EVs形态和纯度分析

图2. 泪液EVs粒径和浓度分析图3. 泪液EVs蛋白标志物分析

图4. 泪液和唾液EVs的TF分析

采用纳米流式检测技术分析了泪液EVs的纯度、大小分布、颗粒浓度以及8种膜蛋白的表达情况。并且，泪液EV存在大量的TF表达，表现出强烈的凝血活性，为眼科研究提供新的研究视角。

CHINESE J ANAL CHEM, 2021, 48(10), 1305-1314.